Резюме
Рассматривается
пептидообразование в эпифизе в светлое время суток, когда метаболическая
активность пинеалоцитов, связанная с синтезом индоламинов (мелатонина)
невелика, и изменения секреции железой других веществ, в частности пептидной
природы, выходят на первый план. Высокая стрессозащитная активность
пептидных гормонов эпифиза и успешный опыт их клинического применения
делают весьма перспективным исследование вовлечения эпифиза, наряду
с гипоталамо-гипофизарной системой, в общий адаптационный синдром. Проведено
исследование пептидных экстрактов эпифиза интактных и подвергнутых 48-часовой
водной и пищевой депривации крыс методом высокоэффективной жидкостной
хроматографии. При стрессе обнаружено увеличение продукции железой серотонина,
связываемое нами со снижением активности N-ацетилтрансферазы под действием
кортикостерона, а также увеличение фракции гидрофильных высокомолекулярных
пептидов. Кроме того, в эпифизе при стрессе зарегистрировано увеличение
содержания вазопрессина, что вероятно, может иметь регуляторное значение.
Введение
Гормонам
эпифиза посвящено огромное число научных публикаций, однако большинство
из них касается мелатонина, максимум секреции которого наблюдается в
темное время суток. В литературе преобладает мнение, что эпифиз активно
секретирует гормоны только ночью, а в светлое время его активность незначительна.
Если судить только по мелатонину, то такая точка зрения могла бы быть
справедливой, однако эпифиз секретирует в кровь также и другие вещества,
особый интерес из которых, в силу их высокой биологической активности,
представляют пептиды [9,11]. Несмотря на успешное применение в клинике
пептидных препаратов эпифиза, в частности эпиталамина, для коррекции
иммунных, онкологических и эндокринных патологий [9] пептидам, по сравнению
с мелатонином, посвящено непропорционально мало работ. Чрезвычайно скудны
сведения о циркадной ритмике их секреции. Именно поэтому весьма актуально
изучение пептидообразования в железе в светлое время суток, когда метаболическая
активность пинеалоцитов, связанная с синтезом индоламинов (мелатонина)
невелика, и изменения секреции пептидных гормонов и серотонина выходят
на первый план.
Эпифиз наряду с гипоталамо-гипофизарным комплексом вовлекается в формирование
множественных адаптационных ответов организма на стрессорное воздействие,
главным образом, за счет влияний со стороны верхнего шейного симпатического
ганглия и ЦНС в I фазу общего адаптационного синдрома и за счет действия
кортикотропина во II его фазу [2]. Показано, что под влиянием страха,
шума, вибрации, иммобилизации, гипергликемии, отсадки потомства у лактирующих
животных, принудительного купания в холодной воде, а также множества
других экстремальных воздействий усиливается продукция эпифизом мелатонина
и веществ пептидной природы [1,3]. Многие эффекты гормонов эпифиза проявляются
только при стрессе и выражаются в противодействии стрессорным повреждениям.
Как известно, удаление эпифиза мало сказывается на жизнеспособности
организма, но только до тех пор, пока последний не подвергается какому-либо
стрессорному воздействию. На основании этих данных выдвигалось предположение,
что эпифиз обеспечивает включение стресс-реализующих и стресс-лимитирующих
механизмов, а в норме его регуляторные влияния на организм невелики
[2].
Химическая структура большинства пептидов эпифиза не установлена. К
идентифицированным, частично очищенным пептидам железы относятся антигонадотропин
(2 и 10 кДа), вазотоцин, окситоцин и вазопрессин. Пептидный фактор 1200
Да, выделенный из эпифиза, специфически регулирует транскрипцию ДНК
в клетках [14]. Вещества белковой и пептидной природы, секретируемые
пинеалоцитами в ответ на некоторые экстремальные воздействия, возможно,
также участвуют в формировании стрессорной реакции организма. Известно,
что пептидный препарат эпифиза «кринофизин» предотвращает гипергликемию,
вызываемую введением норадреналина [12]. Инъекции пептидного препарата
«эпиталамина» сопровождались антистрессорными эффектами [1,8].
Существование «цитомединов» - класса пептидных биорегуляторов, осуществляющих
связь между малыми группами клеток и оказывающих значительное влияние
на их специфическую активность было показано довольно давно [6,9]. Цитомедины
переносят от клетки к клетке определенную информацию, содержащуюся в
последовательности аминокислот и конформационных модификаций. Наибольший
эффект цитомедины вызывают в тканях того органа, из которого они выделены
[4]. Тимус и эпифиз были первыми органами, из которых выделены фракции
низкомолекулярных регуляторных пептидов, обладающих высокой биологической
активностью. Следует отметить, что короткие фрагменты, состоящие из
трех-четырех аминокислотных остатков, нередко оказываются более активными,
чем исходные соединения. Не исключено, что цитомедины, образуемые в
организме или введенные извне, подвергаются процессингу, в результате
которого от суммарного комплекса полипептидов отщепляются фрагменты,
состоящие из нескольких аминокислотных остатков и осуществляющие в данный
момент необходимые регуляторные функции [4].
В связи с высокой биологической активностью пептидов эпифиза и зависимостью
их синтеза от условий среды представлялось интересным изучение гормональных
систем саморегуляции эпифиза при стрессе.
Материалы и методы
В
опытах использовали 5 интактных крыс (контроль) и 5 крыс, подвергнутых
48-часовой водной и пищевой депривации (опыт). Животных декапитировали
и извлекали эпифиз, который немедленно помещали в микропробирку, наполненную
жидким азотом. Вся процедура занимала не более 1 мин. Замороженную эпифизарную
ткань хранили при -70о С до использования.
Для получения олигопептидной фракции эпифизы помещали в микропробирку,
содержащую 200 мкл 0.1Н соляной кислоты, нагретой до 95о С на водяной
бане, инкубировали при этой температуре в течение 10 мин, охлаждали,
гомогенизировали при помощи петлевого гомогенизатора, вращаемого со
скоростью 10000 об/мин в течение 1 мин. Гомогенат обрабатывали ультразвуком
в течение 10 мин, инкубировали при 4оС в течение 1 часа, центрифугировали
при 8000 об/мин в течение 30 мин, собирали супернатант. Супернатант
нейтрализовали до рН 7 2М раствором гидроксида калия, замораживали при
-20оС в течение 10 мин для полного выпадения всех нерастворимых веществ
в осадок и после оттаивания снова центрифугировали при 8000 об/мин в
течение 10 мин. Супернатант собирали и подвергали депротеинизации путем
добавления ацетонитрила до концентрации 60 об.%, инкубировали при 85оС
1 мин, замораживали при -20оС в течение 10 мин для полного выпадения
всех нерастворимых веществ в осадок и после нагревания до комнатной
температуры снова центрифугировали при 8000 об/мин в течение 10 мин.
Супернатант отделяли и выпаривали в токе теплого азота при 40оС до объема,
приблизительно в 2 раза меньше первоначального объема экстракта. Затем
объем экстракта доводили бидистиллированной водой до объема первоначального
экстракта, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 5 мин.
Полученный депротеинизированный экстракт использовали для анализа методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии. Хроматографическая система
включала 2 насоса высокого давления БПЖ-71 и программирующее устройство
САА-08 жидкостного хроматографа “Цвет 3110”, динамический и статический
смесители (Amicone), петлевой инжектор Rheodyne 7125, предколонку 2Х7
мм с сорбентом Сепарон С-18 5 мкм, хроматографическую колонку 3Х150мм
с тем же сорбентом, фотометрический детектор Uvicord S11 (LKB) и компьютеризованную
систему сбора и анализа хроматографических данных на базе IBM PC 486
с программным пакетом «Мультихром v1.39». Для анализа вводили пробу
ультрафильтрата объемом 10-150 мкл и хроматографировали в градиентном
режиме со скоростью подачи элюэнта 320 мкл/мин. Стартовый элюэнт А -
раствор однозамещенного фосфата натрия концентрацией 50 мМ с добавлением
0.15 об.% ортофосфорной кислоты, финишный элюэнт Б - элюэнт А с добавлением
50 об.% ацетонитрила.
1с, 10% элюэнта
Б;
7200с (2 часа), 80% элюэнта Б.
Оптическую плотность
регистрировали при длине волны 206 нм. После анализа колонку кондиционировали
при стартовых условиях в течение 20 мин.
Для идентификации пиков хроматограммы использовались стандарты мелатонина,
серотонина, окситоцина, вазопрессина, вазотоцина, эпиталона.
Результаты и обсуждение
Данные о значительном
усилении образования секреторного материала пинеалоцитами при осмотическом
стрессе, полученные нами гистологическими методами [3], характеризуют
только факт накопления секреторного материала, но мало говорят о его
составе. Результаты электрофизиологических экспериментов также свидетельствовали
об активации секреторной активности пинеалоцитов при стрессе [7]. В
связи с этим было предпринято исследование индольных и олигопептидных
фракций эпифиза методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.
При изучении экстрактов эпифиза контрольных крыс и животных, подвергнутых
48-часовой водной и пищевой депривации, выявлено изменение продукции
пинеалоцитами серотонина и мелатонина под действием осмотического стресса.
В эпифизе крыс при стрессе обнаружено приблизительно двукратное увеличение
содержания серотонина (Табл.1) при трехкратном снижении содержания мелатонина,
по сравнению с контролем, что указывает на снижение активности N-ацетилтрансферазы.
Причиной таких изменений, скорее всего, является тормозящее действие
кортикостерона, уровень которого в крови сильно возрастает во 2-ю фазу
общего адаптационного синдрома, на связывание норадреналина с b-адренорецепторами
и, таким образом, на путь превращения серотонина в мелатонин. Не исключено,
что повышение содержания серотонина в эпифизе сопровождается также его
секрецией в кровяное русло, однако это требует дополнительной экспериментальной
проверки.
Таблица
1. Содержание гормонов в эпифизе крыс (моль/эпифиз).
| |
Вазотоцин |
Окситоцин |
Вазопрессин |
Серотонин |
Мелатонин |
| контроль |
1,93.10-11 |
0,16.10-11 |
0,073.10-11 |
0,17.10-11 |
0,0048.10-11 |
| стресс |
1,45.10-11 |
0,21.10-11 |
0,011.10-11 |
0,5.10-11 |
0,003.10-11 |
Незначительное содержание
в эпифизе мелатонина на фоне активных секреторных процессов при осмотическом
стрессе говорит о том, что в дневное время эпифиз также вовлекается
в стрессорный ответ, но секретирует в кровь не мелатонин, а другие гормоны
пептидной природы и серотонин.
Нами обнаружено значительное увеличение фракции гидрофильных высокомолекулярных
пептидов (несколько кДа) в экстракте эпифиза при осмотическом стрессе.
Вероятно именно эта фракция составляет основной объем гранул с пептидным
содержимым, накопление которых при осмотическом стрессе зарегистрировано
в пинеалоцитах методами электронной и световой микроскопии. Кроме того
в эпифизе при осмотическом стрессе зарегистрировано 3,5 кратное увеличение
содержания вазопрессина, по сравнению с контролем. Достоверных изменений
содержания окситоцина или вазотоцина зарегистрировать не удалось.
Наиболее существенными источниками вазопрессина в эпифизе могут быть
нервные терминали из паравентрикулярного и супраоптического ядер гипоталамуса,
а также поступление гормона из плазмы крови. Это выглядит правдоподобным,
поскольку при осмотическом стрессе наблюдается усиление продукции вазопрессина
гипоталамо-гипофизарной системой и увеличение его концентрации в плазме
крови [10]. Рост концентрации вазопрессина в эпифизе при осмотическом
стрессе, вероятно, может иметь регуляторное значение и требует дальнейшего
изучения. Незначительные изменения содержания в эпифизе при стрессе
окситоцина и вазотоцина могут быть связаны с циркадной ритмикой этих
гормонов. В частности, пик наибольшей секреции вазотоцина эпифизом приходится
на ночные, а не дневные часы [13].
Активная секреция эпифизом пептидных гормонов при таком хроническом
виде стресса как осмотический скорее всего носит адаптивный характер,
поскольку пептиды эпифиза препятствуют таким цитотоксическим процессам,
как образование свободных радикалов, апоптоз, стрессорная иммунодепрессия.
Торможение при осмотическом стрессе синтеза пинеалоцитами мелатонина,
адаптогенные свойства которого также хорошо известны, по-видимому определяется
характерным для светлого времени суток дефицитом симпатической стимуляции
железы, а также длительным избытком кортикостерона в крови.
Литература
1. Аpушанян Э.Б., Аpушанян Л.Г., Элькебян
К.С. Место эпифизаpно - адpенокоpтикотpопных отношений в попpавочной
pегуляции поведения // Успехи физиол. наук.- 1993.- Т.24, N 4, c.12-23.
2. Анисимов В.Н. Физиологические функции эпифиза (геронтологический
аспект) // Росс. Физиол. Журн. им. И.М.Сеченова.- 1997.- T.83, N8, c.1-13.
3. Коваленко Р.И., Сибаров Д.А., Павленко И.Н., Лукьянова Е.Л., Ноздрачев
А.Д. Структура пинеалоцитов крысы при стрессе и после унилатеральных
и нтраназальных введений окситоцина // Росс. физиол. журн. им.И.М.Сеченова.-
1997.- Т.83, N8, с.87-93.
4. Кузник Б.И., Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Цитомедины: 25-летний опыт
экспериментальных и клинических исследований. // СПб.: Наука. 1998.
5. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Выделение из костного мозга, лимфоцитов
и тимуса полипептидов, регулирующих процессы межклеточной кооперации
в системе иммунитета // Докл. АН СССР.- 1981.- Т.261, N 1, с.235-239.
6. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Новый класс биологических регуляторов
многоклеточных систем – цитомедины // Успехи соврем. биол..- 1983.-
Т.96, вып.3(6), с.339-352.
7. Сибаров Д.А., Коваленко Р.И., Ноздрачев А.Д., Особенности функционирования
пинеалоцитов крыс при стрессе в светлое время суток // Росс.Физиол.журн.-
2000.- Т.86, N.8, c.1049-1052.
8. Слепушкин В.Д., Пашинский В.Г. Эпифиз и адаптация организма // Томск,
изд-во Томского ун-та, 1982, 210с.
9. Хавинсон В.Х., Морозов В.Г. Пептиды эпифиза и тимуса в регуляции
старения // ИКФ «Фолиант», СПб.
10. Aguilera G., Lightman S.L., Kiss A. Regulation of the hypothalamic-pituitary-adrenal
axis during water deprivation // Endocrinology.- 1993.- Jan; V.132,
N.1, p.241-248.
11. Lukaszyk A., Reiter R.J. Histophysiological evidence for the secretion
of polypeptides by the pineal gland // Am. J. Anat.- 1975.- V.143, N.4,
p.451-464.
12. Nanu L., Ionescu V., Marcean-Petrescu R. The inhibitory effect of
crinofizin (pineal peptide extract) on adrenalin-induced hyperglycemia
in rabbits. // Endocrinologie.- 1978.- Jan, V.16, N 1, p.11-14.
13. Pavel S. Arginine vasotocin as a pineal hormone // J.Neural.Transm.-
1978.- V.13, N1, p.135-155.
14. Petrelli C., Moretti P., Petrelli F., Barra D. Purification of a
low molecular weight calf pineal peptide controlling DNA transcription
in vitro // Ital. J. Biochem.- 1992.- V41, N3, P.170-182.