ФЛЮОРЕСЦЕНТНО-МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СВЯЗЫВАНИЯ ЭПИТАЛОНА

Регуляторные пептиды играют ключевую роль в регуляции и реализации функций организма. Применение регуляторных пептидов в последнее время привлекает пристальное внимание исследователей в связи с проблемой коррекции или профилактики последствий пре- и постнатальных шоковых состояний, в том числе и плацентарной недостаточности [9].
Тимус и эпифиз были первыми органами, из которых выделены фракции низкомолекулярных регуляторных пептидов, обладающих высокой биологической активностью. Одним из таких пептидов был эпиталамин, представляющий собой экстракт из эпиталамо-эпифизарной области мозга, полученный методом уксуснокислой экстракции. Препарат содержит комплекс веществ полипептидной природы. При этом высокомолекулярные вещества в нем отсутствуют [6]. Он обладает тропным действием в
отношении эпиталамо-эпифизарной области мозга, модулирует деятельность гипоталамо-гипофизарной системы и ряда других органов [4].
Эпиталон представляет собой тетрапептид (Ala-Glu-Asр-Gly), сконструированный на основе анализа аминокислотной структуры эпиталамина в Санкт-Петербургском Институте биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН. Предполагается, что эпиталон может обладать более высокой биологической активностью, чем его предшественник [12]. Зарегистрированы геропротекторный, антиоксидантный, противоопухолевый эффекты эпиталона [10, 12]. Возможно эпиталон является одним из биологически активных факторов, регулирующих работу эпифиза. Пептидный фрагмент Ala-Glu-Asp-Gly встречается в различных эндогенных регуляторных белках и пептидах (протимозине, паратимозине, цитостатине, тропонине, тиреоглобулине, молекуле адгезии нейронов, кальмодулин связывающих белках GAP-43 и P-57) [5]. Таким образом, вполне вероятно образование эпиталона в клетках в результате протеолиза белков-предшественников.
Имеющиеся литературные данные о свойствах эпиталона касаются, главным образом, его онкостатических и антиоксидантных свойств. Конкретные механизмы действия пептида на клетки и системы регуляции организма остаются неизвестными. Однако, в некоторых работах существуют косвенные свидетельства в пользу существования рецептора к этому тетрапептиду. В частности, на это указывает чрезвычайно низкая концентрация препарата, необходимая для проявления его регуляторных свойств [8, 10]. В этой связи изучение связывания эпиталона тканями матери и плода, а также проникновения его через плацентарный барьер, представляется значимым и актуальным.

Методика исследования

В опытах использовался эпиталон, ковалентно связанный на N-конце с дансилом (флуоресцентным красителем, максимумы λпоглощ.=330нм, λиспуск.=530нм). Молекулярная масса препарата 622.34 amu. Чистота по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии более 95%.
Эксперименты проводились на 12 половозрелых самках кроликов породы Шиншила, весом 4,5 – 5 кг, которых содержали в виварии в обычных условиях при естественном освещении и сбалансированном рационе. Животных разделили на 2 группы: №1 – контрольная группа и №2 – опытная группа животных, которым вводили эпиталон. С целью создания возможности попарного сравнения реакций плодов, развивающихся в условиях нормального кровоснабжения и в условиях нарушенного маточно-плацентарного кровотока беременным самкам кролика на 18-й день беременности производили полостную операцию под эфирным масочным наркозом. В ходе операции в одном роге матки перевязывали примерно 1/3 преплацентарных сосудов у каждого плодовместилища, создавая дозированное уменьшение притока крови к материнской части плаценты, приводящее в дальнейшем к задержки развития плодов этого рога матки. Второй рог матки оставался интактным. В конце беременности (на 29 день) производили однократное внутривенное введение эпиталона, меченого флюоресцентным красителем, в концентрации 30 мкг на 1 кг массы тела. Через 1 час после инъекции животных забивали методом воздушной эмболии с последующим вскрытием. В ходе вскрытия производили взятие морфологических образцов тканей органов самок кроликов, а также нормальных плодов и плодов с плацентарной недостаточностью в каждой исследуемой группе. Кусочки тканей органов матери (печени, легкого, мозга, желудка, кишечника) и плода (печени, легкого, мозга, желудка, кишечника и плаценты) замораживали и использовали для приготовления криостатных срезов, анализ которых проводили в тот же день с помощью флюоресцентного микроскопа Zeiss Axiostar plus.

Результаты исследования

Меченный дансилом эпиталон свободно циркулирует в организме матери. Связывание эпиталона обнаруживалось во всех исследуемых тканях матери: печени, легких, мозге, желудке, кишечнике; при этом наблюдалось в основном яркое равномерное или очаговое свечение, с преимущественной локализацией метки на клеточных мембранах (рис. 1, 2, 3).
Связанный с дансилом эпиталон проникает также во все исследуемые ткани нормальных плодов (рис. 4, 5, 6) и плодов, развивающихся в условиях плацентарной недостаточности (рис. 7, 8, 9) (печень, легкие, мозг, желудок, кишечник). Интересно отметить, что в легких, печени, желудочно-кишечном тракте свечение более яркое и интенсивное, чем в тканях плаценты и мозга, где наблюдается слабое диффузное свечение. При этом при плацентарной недостаточности включение меченного эпиталона в ткани плаценты наблюдалось чаще, чем при нормальном развитии плодов.
В тканях матери и плодов контрольной группы животных отсутствовало характерное свечение флюоресцентной метки.
Полученные нами результаты демонстрируют свободное проникновение эпиталона практически во все ткани матери и плодов, что можно объяснить его небольшими размерами и низкой молекулярной массой. По-видимому, транспорт этого низкомолекулярного пептида через плацентарный барьер происходит путем диффузии.
В последнее время изучению действия регуляторных пептидов на пре- и постнатальное состояние потомства у млекопитающих был посвящен целый ряд исследований. Так, исследования М.В. Масловой (1999) показали, что профилактическое однократное внутрибрюшное введение семакса в дозах 0,05 и 0,1 мг/кг достоверно уменьшало вызванную гипоксией брадикардию у 14- и 21-дневных крысят, а также оказывало антиаритмическое действие, устранял влияние гипоксии на показатели ориентировочно-исследовательской реакции в постгипоксическом периоде [9]. Предварительное, до моделирования гипоксии, введение в матку обезьян мепиридина (агониста опиоидных рецепторов) в дозе 2 мг/кг приводит к устранению большинства негативных эффектов у потомства [13]. Другой регуляторный пептид – тиролиберин – при однократном внутривенном введении в дозе 50 мг недоношенным детям с гипоксическим поражением головного мозга повышает уровень кровяного давления и нормализует мозговое кровообращение в магистральных артериях [3].
До 65% детей, перенесших плацентарную недостаточность в пренатальном периоде, имеют какую-либо патологию, нарушение адаптации или отставание в развитии, а также высокую частоту поражения ЦНС (до 30%). Плацентарная недостаточность приводит к нарушению транспортной, трофической, эндокринной, метаболической и других важнейших функций плаценты. В основе плацентарной недостаточности любой этиологии лежат нарушения плацентарного кровообращения, включая микроциркуляцию, и обменных процессов, которые тесно связаны между собой и взаимообусловлены [7]. Известно, что регуляторные пептиды, обладающие чрезвычайно высокой физиологической активностью, могут действовать как медиаторы, а также, попадая в кровоток, выполнять функции эффекторных физиологических агентов или модуляторов метаболизма, т.е. истинных гормонов [1, 2].

Полученные данные свидетельствуют о быстром включении эпиталона в процессы метаболизма практически во всех тканях матери и плода, как при нормальной беременности, так и при беременности, осложненной плацентарной недостаточностью, что дает основания считать перспективным дальнейшее изучение регуляторных свойств этого пептида в функциональной системе мать-плацента-плод.

Работа поддержана грантами Министерства образования России PD02-1,4-159 и грантом Фонда содействия отечественной науке.

Литература
1. Ашмарин И.П. Нейрохимия. М.: НИИ биомедицинской химии РАМН, 1996. 470 с.
2. Ашмарин И.П., Стукалов П.В., Ещенко Н.Д. и др. Биохимия мозга. СПб.: Изд-во С.-Петербургского университета. 1999. 328 с.
3. Иониди В.Ю., Дуленков А.Б., Ашмарин И.П. и др. Тиролиберин – антигипоксическое действие и нормализация мозгового кровообращения в клинике реанимации новорожденных // Сб. отчетных статей. М: 1991. № 20. С 20, 52-53.
4. Кузник Б.И., Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Цитомедины: 25-летний опыт экспериментальных и клинических исследований. // СПб.: Наука. 1998.
5. Малинин В.В. Механизмы действия синтетических пептидных тимомиметиков. Автореф. дис. на соиск. учен. степ. д.м.н. СПб, 2001
6. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Пептидные биорегуляторы (25-летний опыт экспериментального и клинического изучения) // СПб. Наука, 1996, 74с.
7. Савельева Г.М., Федорова М.В., Клименко П.А., Сичинаева Л.Г. Плацентарная недостаточность. М: Изд-во «Медицина». 1991. 272 с.
8. Сибаров Д.А., Коваленко Р.И., Ноздрачев А.Д., Малинин В.В., Хавинсон В.Х. Влияние пептидов эпифиза на спонтанную электрическую активность пинеалоцитов крыс // ДАН, биол.науки, 2002, 385(4):568-570.
9. Соколова Н.А., Маслова М.В., Маклакова А.С., Ашмарин И.П. Пренатальный гипоксический стресс: физиологические и биохимические последствия, коррекция регуляторными пептидами. // Успехи физиологических наук. 2002. Т. 33, № 2. С.56-67.
10. Хавинсон В.Х., Анисимов В.Н. Синтетический пептид эпифиза увеличивает продолжительность жизни и угнетает развитие опухолей у мышей // Докл. АН, 2000, Т.374, N.5, с.710-711.
11. Хавинсон В.Х., Мыльников С.В. Влияние тетрапептида эпифиза на состояние антиоксидантной защиты у Drosophila melanogaster // Бюлл., эксперим. биол. и мед., 2000, Т.129, N.4, с.420-422.
12. Хавинсон В.Х., Мыльников С.В. Влияние тетрапептида эпифиза на состояние антиоксидантной защиты Drosophila melanogaster// Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2000. Т. 129, № 4. С. 420-422.
13. Golub M.S., Eisele J.H., Donald J.M. Effect of intrapartum meperedine on the behavioral consequnces of neonatal oxygen deprivation in the rhesus monkey infants.// Dev. Pharmacol. Ther. 1991. V. 16 (4). P. 231-240.

Рис 1,2,3. Распределение флюоресцентного сигнала в тканях самки кролика:

	легкие
	кишечник
	печень

Рис. 4,5,6. Распределение флюоресцентного сигнала в тканях нормального плода:

	мозг
	желудок
	плацента

Рис. 7,8,9. Распределение флюоресцентного сигнала в тканях плода с плацентарной недостаточностью:

	легкие
	кишечник
	плацента