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Vamos a realizar dos prácticas. En una vamos a observar los invertebrados de un sector típico de los que usamos en 023b (trabajo práctico). En el segundo buscaremos conocer los principios prácticos de la microscopía, con preparación de muestras para observar.
BIODIVERSIDAD DE INSECTOS
En una ocasión previa hemos buscado un yuyal cercano a nuestra residencia, lo hemos marcado con un piolín y no hemos hecho una búsqueda de insectos e invertebrados en ese sitio. Ahora hay que intentar hacerlo. En los lotes marcados busque insectos y pequeños invertebrados, lo cual es obviamente más difícil que buscar las plantas, que por lo menos se quedan quietas. Llamelos con nombres de fantasía si no sabe el verdadero nombre. Registre su biodiversidad y su número absoluto. Extraiga conclusiones razonadas, en base a su experiencia previa.
en inhibir el crecimiento bacteriano y fungal mediante la misma sequedad que suelen exhibir las semillas originales previas al brotado, sequedad descubierta por la selección natural como remedio a su ataque.
Notas: Alfalfa: germina en tres a seis días y se busca un largo de 3 a 4 cm; tiene sabor a nuez.
Avena: se omite el remojo inicial y se enjuaga una vez al día. En tres o cuatro días tienen el largo óptimo que es cuando duplican el tamaño inicial.
Calabaza: se vuelve amarga si el húsar supera medio cm
Girasol: tarda mucho más que el resto y tambien se vuelve amarga al empezar a emerger el húsar. Es muy rica en minerales como el fluor y el iodo.
Lenteja: brotes óptimos de tres o cuatro días o sea 2 cm
Maíz amarillo: brote de 1 cm es la medida conveniente.
Mijo: son brotes alcalinos que actúan de reguladores del pH de la digestión. Tardan tres o cuatro días para llegar al medio cm de largo, que es el adecuado.
Porotos: hay muchas especies y cultivares distintos. A veces están bien con un brote de 2 a 4 cm. Como son duros, hay que cocinarlos previamente a la ingesta.
Soja: es una leguminosa completa con todos los aminoácidos esenciales y un 40 % de proteínas. La etapa 3 se debe repetir a menudo, 5 veces diarias o más y los brotes comerciales tienen 4 cm
Trigo: momento de cosecha es con 1 cm de largo. Por ser duro, se debe cocer antes de ingerir. Otra nota: este trabajo práctico se puede extender tambien a las condiciones que deben mantener las semillas en forma previa a su procesamiento. El "invento" de la semilla exige condiciones de sequedad para que no empiece el brote que estamos estudiando en una época fuera de nuestros intereses. Durante ese período las semillas respiran y están vivas. Las que mueren se debieran retirar apenas se las pueda reconocer por comparación, porque son fuente de microorganismos saprófitos que no son agradables de mezclar con los brotes a ingerir. Las técnicas para hacer brotar tubérculos se basan en ubicarlos en vasos con soportes especiales y agua en el fondo. Pueden partirse y lo mismo brotan. Los brotes son un problema para la preservación hasta llegar el invierno en países fríos como Polonia y Rusia, para los que la papa es la base de la alimentación humana. El secado en cintas sin fin calefaccionadas con gases calientes es el gran recurso para evitar la pudrición del alimento, en general escaso.
MICROSCOPIO
Consiga a alguien que le deje ver un microscopio y que, con su experiencia, le evite a usted errores de manejo que puedan ser importantes.
1. BASE, SOPORTE, BISAGRA DE INCLINACION, BRAZO Y CUERPO DEL TUBO. La base, soporte y brazo sirven para mantener en la correcta posición a las partes ópticas esenciales. La base y el brazo son gruesos y fuertes, para disminuir la vibración. En los modelos más antiguos una bisagra de inclinación en el soporte, justamente debajo de la platina, permite que la parte superior del microscopio se incline hacia atrás, en cualquier grado que se desee. En los instrumentos modernos se inclina hacia el observador todo el cuerpo del tubo, al cual están unidas las lentes principales, como en la figura zz.
2. TUBOS INTERCAMBIABLES, REVOLVER O PORTAOBJETIVOS, LONGITUD DEL TUBO. En los microscopios escolares más antiguos el tubo intercambiable, que se puede extraer tirando hacia arriba, se encuentra encajado en la parte superior del cuerpo del cuerpo del tubo. En éste se coloca el ocular. El tubo intercambiable tiene la siguiente finalidad: permite ajustar la longitud del tubo, es decir, la distancia entre la lente del ocular que está arriba y la unión del objetivo al revólver, que está abajo. La longitud adecuada dell tubo se puede indicar por una línea que corra alrededor del tubo intercambiable. La mayoría de los microscopios modernos tienen una longitud de tubo fija y oculares dobles, que permiten utilizarlos con los dos ojos.
3. AJUSTES MACROMETRICO Y MICROMETRICO PARA ENFOCAR. Todo el cuerpo del tubo junto con sus lentes (o en los modelos más recientes, la platina y el condensador) se mueven hacia abajo y hacia arriba, con la ayuda de un tornillo de ajuste macrométrico. El tubo o la platina pueden subir o bajar muy ligeramente, mediante un tornillo de ajuste micrométrico. La finalidad de estos ajustes es poner la muestra en el foco, de manera que sus bordes sean nítidos y claros. Ambos ajustes, el macro y el micro, deben manejarse cuidadosamente, sobre tod el último, dado que su mecanismo es muy delicado. El recorrido del tornillo micrométrico es muy limitado y no puede ser forzado. Hay un tope para arriba y otro para abajo. Mantenga usted el tubo en un punto intermedio, adquiriendo habilidad con el tornillo macro primero y micro despues y retocando con el macro si el micro llega a uno de sus topes.
4. PLATINA. Es la zona donde se coloca la muestra. En la mayoría de los trabajos la muestra es un preparado transparente u otra preparación sobre placa de cristal o portaobjetos.
5. ESPEJO, CONDENSADOR Y DIAFRAGMA. El espejo ajustable recoge y refleja la luz hacia el microscopio. Pues esa luz se condensa y enfoca al pasar por una gran lente condensadora que se halla debajo de la platina para finalmente iluminar por debajo a la muestra. Con esto se consigue aportar mucha luz a esa muestra, lo cual es una exigencia especial en el caso de lentes de gran aumento. A veces ocurre que la muestra queda demasiado brillante con la iluminación provista por el condensador, motivo por el cual bajo el condensador hay un diafragma iris. El tamaño de la apertura del diafragma es regulable moviendo una palanquita. Así se puede regular la cantidad de luz cómoda de emplear. Si usted quiere ver microbios vivos sin tinción le conviene tener luz difusa. Para ello hay que descender el condensador y el diafragma. En microscopios que tienen condensador divisible, se puede retirar la parte superior. Una opción de los microscopios modernos es la de proveer condensador y espejo combinados en una sola unidad, con luz eléctrica ajustable.
6. OBJETIVOS. Son la parte óptica realmente importante. Limitan el tamaño de la imagen y son los responsables de una buena calidad de visión. Muchos microscopios tienen un revólver con tres objetivos. El revólver permite usar uno sólo por vez, pudiendo ser pequeño aumento, gran aumento y objetivo de inmersión en aceite.
OBJETIVO DE PEQUEÑO AUMENTO. Este es muy útil para examinar micrroorgasnismos grandes y células comunes, así como colonias de microbios. Es más corto que los otros dos, aunque en su extremo la lente es mayor que el resto. Tiene escrito ya sea un 3, o bien 2/3, o tambien 16 mm
OBJETIVO DE GRAN AUMENTO. Suele estar marcado con 6, o con 1/6 o con 4 mm . Permite ver microorganismos vivos en gotas suspendidas de portaobjetos cavados.
Fig de un portaobjetos cavado con gota suspendida
OBJETIVO DE INMERSION EN ACEITE. Es el más útil en bacteriología y se presenta diferente a los otros dos. Dice "oil immer" u "homog. immer" o tambien 1/12, 1.9 mm o 1.8 mm. Los objetivos tienen un aviso adicional de su potencia amplificadora, tales como 10 X, 45 X, 97 X y ademas N.A. seguido de una cifra (N.A. = apertura numérica). A mayor valor para N.A. tanto mayor es el detalle con el cual se aprecian por separado dos puntos cercanos en la muestra: * en los objetivos que no son de inmersión, N.A. como tope vale 1.0, en realidad inalcanzable * en los objetivos para inmersión, N.A. vale habitualmente 1.25 La definición de N.A. tiene como base el tamaño del haz de luz que puede aceptar el objetivo en cuestión. La interpretación de indicaciones como 16 mm, 4 mm o 2 mm es la siguiente: ubique el objetivo a 16, 4 o 2 mm de la muestra o menos (la última cifra es para portaobjetos con una gota de aceite ubicada donde va a sumergirse el objetivo).
7 OCULARES Los oculares son tubos cortos, cada uno con dos lentes, colocados en el extremo superior del cuerpo del tubo binocular, extremo al cual acercamos los ojos. Ellos amplifican la imagen del objeto formada por el objetivo. Sus indicaciones 5 X o 10 X se interpretan que la imagen del objetivo aumentará 5 ó 10 veces. Multiplicando entre sí las indicaciones de objetivos y oculares se llega a cifras similares a 100 ó 500, que es la amplificación final. Con inmersión se accede a cerca de 1000 aumentos totales.
8 PRINCIPIO DEL OBJETIVO DE INMERSION. Mientras que los objetivos secos tienen aire entre el objetivo y la muestra, el de inmersión tiene un aceite especial (de cedro) con el mismo índice de refracción que el vidrio. El índice de refracción está relacionado con la velocidad real de la luz en medios que no son el vacío. No es lo mismo el índice del aire que el índice del vidrio. Si todo tiene, entre objetivo y vidrio sobre el cual está la muestra, el mismo índice, el valor del N.A. resulta ser mayor. Esa es la ventaja del aceite de cedro.
Diagrama del paso de la luz con diferentes indices de refraccion pag62
9 USO Y VALOR DE LENTES DE INMERSION Y PODER DE RESOLUCION. Cuando se emplea un objetivo de inmersión con ocular de 10 X tenemos un aumento final de 970 ó 1000 X que resulta de buena nitidez en muchos microscopios. Cambiando 10 X por 15 X en los oculares deteriora la nitidez de la imagen. El poder de resolución se controla mediante la apertura numérica N.A. pero está limitado por la longitud de onda de la luz. Nuestro ojo no alcanza a ver nitidamente objetos más pequeños de la mitad de longitud de onda de la luz usada. La luz en el rango óptico tiene entre 0,4 y 0,8 m (sinónimo de micra) y su valor central (verde) es 0,6 m. Con un microscopio óptico vemos bien hasta un mínimo de tamaño de 0,3 m. Otros microscopios que usted dificilmente consiga no se basan en la longitud de onda de la luz óptica, sino en la de los electrones o del ultravioleta y distinguen así objetos más pequeños. Los microscopios de contraste de fases con lentes y condensadores fabricados de otra manera, nos permiten ver detalles de la muestra sin teñir en un portaobjetos cavado, resultando en una visión sobre fondo gris recordable para toda la vida.
2 METODOS DE MICROSCOPIA
EXAMEN DE ORGANISMOS VIVOS
La forma más simple de ver microorganismos y células vivos es suspenderlos en agua, colocar una gota sobre un portaobjetos común y cubrirlo con un cubreobjetos de manera que la gota quede desparramada.
Una experiencia curiosa consiste en observar el movimiento browniano, resultado del choque sobre la estructura viva (o muerta) de moléculas invisibles que se adivinan por el efecto de su impacto. A medida que usted se perfecciona, querrá desengrasar los cubreobjetos con jabón y agua y enjuagarlos con agua caliente, sumergirlos en alcohol y calentarlos suavemente cerca de una llama, antes de empezar. Le va a costar al principio enfocar bien por lo cual si hace una pequeña marca en el cubre cerca de la gota, esa marca le servirá para la tarea de enfoque. Su principal tarea será localizar la marca.
EXAMEN DE PREPARADOS La tarea siguiente es teñir, esto es, ejecutar preparados teñidos. La manera tradicional de empezar es usar yodo y yoduro potásico o tinta china y si está cerca de un proveedor de material de laboratorio, nigrosina. Le vamos a dar tres protocolos de trabajo.
METODOS PRINCIPALES
PRIMER PROTOCOLO (ALGUNAS CELULAS HUMANAS)
1. Instalar el microscopio y la luz. 2. Acondicionar portaobjetos y cubreobjetos limpios 3. Preparar LUGOL: un cristalito de yodo en un vaso de precipitados con 25 cm3 de agua y luego dos veces un montoncito de yoduro potásico aportado con la espátula (un tipo de destornillador aplanado y de poco espesor). Mezclar. Se usa en 9. 4. Con una cuchara de café limpia raspar suavemente el interior de la mejilla dos o tres veces. Colocar lo raspado en el centro de un portaobjetos. 5. Tapar la saliva y la pasta blancuzca con un cubrobjetos, de manera que queden como sandwich. A contraluz se verán burbujas de aire, que se volverán a ver con el microscopio. 6. Mirar con poco aumento. Enfocar. Descubrir las burbujas de aire. Tienen un borde grueso. No llevarles más el apunte. Estudiar el resto del preparado. Hay muchas formas ovaladas casi transparentes. 7. Cambiar el aumento. Comparar el borde de la forma ovalada con el borde de la burbuja. Descubrir el núcleo de la forma ovalada. Descubrir los orgánulos o granulaciones al azar entre el núcleo y la membrana. 8. Observar la presencia de otras células similares. Compararlas entre sí. Buscar arrugas en las membranas celulares, usando el enfoque fino (tornillo micrométrico). 9. Empezar de nuevo con la etapa 4. Añadir una gota de Lugol. Cubrir con el cubreobjetos y repetir todo. El yodo colorea más al núcleo que al citoplasma (frotis). Opcional: Comenzar sus experiencias con inmersión de aceite, si lo consigue. Inventar alguna manera de estimar el tamaño de las células de la mejilla y del núcleo de las mismas. Solución al final del módulo.
SEGUNDO PROTOCOLO (CELULAS DE CEBOLLA)
1. Cortar una cebolla a lo ancho. 2. Quitar una tela de la media cebolla. 3. Arrancar la película transparente y brillante de la superficie externa de la tela, haciendo un pequeño corte en la película y tomando una punta del borde para desprenderla. 4. Ponga la película ya sea en una gota de agua, ya sea en una gota de Lugol, previamente depositada en el portaobjetos limpio. Cubrir con el cubreobjetos. 5. Buscar burbujas de aire con poco aumento, para no confundirse más adelante. 6. Estudiar las formas de las células y cómo se agrupan en láminas planas. Observar los bordes de las células y buscar la pared celular gruesa y transparente. Normalmente no se podrá distinguir la membrana de la célula, adosada a la pared celular gruesa. 7. Descubrir el núcleo y la vacuola llena de líquido y envuelta por una membrana. Buscarla cerca del borde interno del citoplasma. Calcular tamaños.
TERCER PROTOCOLO (CULTIVO DE BACTERIAS)
1. Disponer de portaobjetos limpios segun explicaciones previas.
2. Dejar algo de caldo de carne o de verdura, o bien leche diluida, a la intemperie, o bien obtener una gota de pus.
3. Preparar nigrosina con 5 ó 10 g de nigrosina en 100 cm3 de agua destilada, hirviendo 30 minutos y agregando 0,5 cm3 de formalina para matar contaminates. Filtrar con embudo con papel de filtro y guardar esterilmente en frasco, operando similarmente a lo que se debe hacer para preparar leche bovina para un lactante.En su defecto, conseguir un frasco de tinta china.
una gota de nigrosina o tinta china o Lugol. Extender una muy pequeña gota emulsionada, obtenida con un ansa (un alambre de platino con un anillo de 2 mm aproximadamente y un mango) que se embebe en la emulsión para formar un preparado delgado o humedecer un algodón y extenderlo en su parte mojada por el portaobjetos. El resultado buscado de una o de otra manera, es el de lograr una película delgada, de manera que la luz pueda pasar en forma abundante por la muestra. 5.
Permitir que el preparado se seque al aire. Con experiencia, ahorrando agua, se logra que esto ocurra rapidamente.
6. Examinar el preparado seco con objetivo de inmersión y aceite de cedro. La nigrosina o la tinta china no se logra combinar con las bacterias, lo cual las resalta notablemente. El Lugol tiñe de diferente forma y se ven bacterias teñidas.
OTRAS OPCIONES
PRIMERA OPCION
Omitir 3 y 4. En su lugar, con un algodón lograr una capa delgada del caldo sin teñir, desparramado por el portaobjetos.
5.bis. En lugar del 5 recién explicado, seguir esta otra técnica llamada de fijación del preparado: Fijar el preparado. Esto significa pasar rapidamente , con el preparado hacia arriba, por la parte superior de un mechero de gas, tres veces seguidas. Aunque con ello las bacterias no necesariamente se mueren, quedan adheridas al portaobjetos.
6.bis. Seguir una técnica tipificada de tinción que deberá buscar en el texto de Microbiología de Alimentos, como por ejemplo la muy popular tinción de Gram, descubierta por un médico danés de ese apellido (1884) que distingue dos tipos de bacterias con membranas externas muy diferentes entre ellas y que tambien emplea el Lugol. Siempre se debe usar abundancia de solución colorante y se debe evitar que el colorante se seque sobre el ptrparado. El tiempo necesario para una buena tinción se aprende con la experiencia, válida solo para la solución tal como se la preparó. Algunas técnicas piden al final un secado a la llama, antes del examen microscópico, generalmente con inmersión de aceite.
SEGUNDA OPCION
Ubicar una gotita de sangre en el centro del portaobjetos y desparramar con uno de los cuatro bordes del cubreobjetos, sosteniendo con dos dedos los otros dos bordes vecinos al usado. Fig xyz fig xyz p 70 "Peinar" el portaobjetos con el cubreobjetos y depositar a continuación el cubreobjetos sobre el portaobjetos. Esta técnica es muy cómoda si usted no tiene ansa y se puede adaptar a otros casos.
1. Localizar en el microscopio la función que satisfacen las siguientes partes: base,soporte, bisagra de inclinación, brazo, cuerpo del tubo, revólver, tornillo micro- y macrométrico, platina, espejo, condensador y diafragma.
2. Explicar la función de los tres objetivos del revólver, así como las identificaciones que tienen.
3. Explicar la función del ocular, así como las identificaciones que tiene. Con un ocular 10 X, ¿qué aumento se logra con el objetivo de pequeño aumento, con el de gran aumento y con el de inmersión?
4. Explicar las condiciones que satisface el aceite de cedro, incluyendo cómo se forma la imagen.
5. Explicar poder de resolución y deducción del tamaño más pequeño que presumiblemente se ve claramente con un microscopio común provisto de objetivo de inmersión.
6. ¿Por qué usted prepararía una muestra de gota pendiente?
7. Explicar algunas opciones que aparecen en las técnicas de preparación de muestras.
8. Si usted quisiera dictaminar cuál organismo está presente en un monocultivo, ¿emplearía usted para la emulsión con la cual preparar el preparado agua destilada o agua de canilla? ¿Por qué?
MODULO II UNIDAD 4 CAPITULO 4 FINAL
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