UTILIZAÇÃO DE CÉLULAS DO
CORDÃO UMBILICAL PARA TRATAMENTO DE DOENÇAS HEMATOLÓGICAS E
ONCO-HEMATOLÓGICAS
Processo de criopreservação das células do cordão umbilical
Testes rotineiros de histocompartibilidade
Medula óssea ou células-tronco guardadas como proteção
Equipamento e materiais necessários ao projeto
MATERIAL NECESSÁRIO E ORÇAMENTO
Orçamento para cultura de células
Orçamento para congelamento de células
O transplante de medula óssea é um procedimento curativo para uma variedade de doenças hematológicas e onco-hematológicas, porém, somente uma pequena parcela (25%) dos pacientes apresentam doadores de medula óssea. A utilização de bancos de medula óssea, como exemplo o existente na Fundação Pró-Sangue/Hemocentro de São Paulo (FPS/HSP) tem permitido o encontro de doadores para poucos pacientes. Recentemente, o grupo de transplante de medula óssea da FPS/HSP realizou o primeiro transplante não-relacionado utilizando um doador não-aparentado para uma criança portadora de Anemia de Fanconi, com sucesso.
Sistema HLA: os antígenos do sistema HLA não antígenos de superfície celular codificados por uma série de genes ligados que se agrupam em duas regiões distintas designadas como classe I e classe II. Embora eles sejam diferentes em seqüência e estrutura estes genes controlam o reconhecimento da célula T e a histocompatibilidade em transplante de medula óssea. Os genes de classe I codificam os antígenos HLA-A B e C e os de classe II codificam os HLA-Dr, Dq e Dp. Estes antígenos são definidos de acordo com os padrões da Organização Mundial da Saúde (OMS). A definição precisa dos limites de aceitabilidade das disparidades do HLA para os transplantes utilizando as Células do Cordão Umbilical (CCU) estão para ser determinadas. Isto é importante não somente do ponto de vista clínico mas também irá ser importante para definir o número de pacientes que se beneficiarão do procedimento.
A identificação e o uso de fontes alternativas de células-tronco ("stem cell") abre a possibilidade da realização de transplante para um número maior de indivíduos, particularmente aqueles que não tem doador na família. Sabe-se que a disparidade do sistema HLA (antígenos leucocitarios Humanos), que representam a compatibilidade entre os pacientes e os doadores , é a principal dificuldade na realização deste tipo de transplante.
O transplante de medula óssea consiste na administração de altas doses de quimioterapia com o intuito de distruir o sistema hematológico, imunológico e a neoplasia, isto é convencionalmente denominado de regime de condicionamento. As seguir, a medula óssea é infundida no paciente através de um cateter venoso instalado em veia profunda do pescoço. As células totipotentes ("stem cell") circulam até atingir os sinusóides da medula óssea aonde irão se proliferar e reconstituir a hematopoese. Este período leva aproximadamente de 15 a 21 dias. Um dos problemas comuns a este tipo de procedimento é a Doença do enxerto-contra o hospedeiro (DECH), que se caracteriza pela reação imunológica do enxerto (medula óssea) contra determinados antigênicos presentes no receptor (hospedeiro). Ela se caracteriza pela presença de lesões em órgãos-alvo (pele, fígado intestino e pulmões) variando de quadros leves com a presença de eritema cutâneo até quadros graves com diarréias volumosas, presença de bolhas na pele e eventualmente, evoluindo para óbito. A profilaxia dessa doença é realizada com uso de corticosteróides, ciclosporina e methotrexate. O uso desses agentes imunossupressores facilitam a instalação de infecções oportunistas.
As células do cordão umbilical (CCU) são capazes de reconstituir a hematopoese após altas doses de quimioterapia. Dados provenientes do registro Internacional de Transplante de Medula Óssea demostram que as CCU são capazes de reconstruir a hematose. Até a data de publicação de Registro trinta e cinco receptores (correspondendo a 68%) tinham recebido células com HLA-idêntico, enquanto dez (20%) não apresentavam HIA-idêntico. A profilaxia da doença enxerto-contra hospedeiro foi realizada com Ciclosporina. A sozinha (n=20) ou em combinação com raetilprednisolona, methotrexate ou anticorpo anti-células T(n=26). Os pacientes receberam uma média de 4,3 x 107 cels/kg, variando de 0,8 a 33 x 107 cels/kg. O tempo médio de recuperação hematopoética dos granulócitos foi de 22 dias. A doença do enxerto-contra hospedeiro (DECH) graus II a IV foi raramente vista. Quatro pacientes desenvolveram DECH II-IV, sendo que 2 receberam CCU com 3 Antígenos diferentes, um recebeu 1 antígeno (DR) diferente e outro, recebeu o enxerto com total compatibilidade . A DECH crônica foi observada em 2 de 31 pacientes.
Vários países tem tentado estabelecer este tipo de banco com CCU, dentre eles nos EUA os bancos de Nova Iorque e da Universidade do Arizona, estando em vários estágios de desenvolvimento os bancos de St. Louis, Pittsburg, Minneapolis, Indianapolis e Scattle. Foram também criados os bancos de Milão, Dusseldorf, Paris, Londres e Bristol. O maior é o de Nova Iorque, denominado de New York Center's Placentral Blood Project, que tem armazenado mais de 4.000 unidades de CCU e já forneceu material para 33 transplantes não-aparentados de medula óssea. Seis destes 33 transplantes foram incluídos no Registro Internacional de Cordão Umbilical.
Desta experiência inicial a DECH foi vista em
8 de 33 pacientes, sendo que grau I E 5 grau II. Nenhum caso de
DECH grau III foi observado. Um paciente do sexo masculino de 13
anos e 70 kg com linfoma linfoblástico, que recebeu um CCU
não-idêntico para o locus DRBI é o paciente de maior peso a
ter a recuperação hematopoética. O mais idoso tinha 45 kg de
peso. Tratava-se de uma paciente com Anemia de Fanconi em
transformação, que recebeu CCU com um antígeno diferente no
locus B (posteriormente identificado como diferente também para
Dr através de genotipagem por DNA), que teve boa recuperação
hematopoética sem apresentar evidência de DECH. Ela se encontra
bem e com seguimento atual de 8 semanas após o transplante de
medula óssea. Estas experiências iniciais ajudaram a demonstrar
que a utilização das CCU tanto as relacionadas como
não-relacionadas são capazes de recuperar a hematopoese após
altas doses de quimioterapia e estão possivelmente relacionadas
com baixa incidência de DECH.
O Programa de Transplante de Medula Óssea
(TMO) na Universidade de São Paulo teve início em Fevereiro de
1988 quando uma paciente portadora de Anemia aplástica recebeu a
medula óssea de sua irmã HLA-compatível. Desde então, quase
300 pacientes já receberam um transplante de medula óssea. O
Programa é cadastrado junto ao Ministério da Saúde para
procedimentos de alta complexidade e considerado como Centro de
excelência no Brasil. Atualmente realiza-se TMO para todas as
doenças hematológicas e alguns e alguns tumores sólidos. Os
resultados obtidos com o Programa de TMO é comparável com
outros centros Europeus e Americanos. Recentemente, os dados do
Programa foram apresentados em importante revista médica
americana durante o congresso da Sociedade Americana de
Hematologia. O Programa dispõe de 6 médicos e 1 residente, 6
enfermeiros, 2 farmacêuticos, uma nutricionista, uma assistente
social, uma fisioterapeuta, uma ortopedista e um
otorrinolaringologista que trabalham período integral junto a
Universidade de São Paulo, a FPS/HSP e HCEMUSP. Além disso,
conta com um laboratório de Imunogenética aonde são realizados
as tipagens HLA tanto de classe I como classe II, estes últimos
realizados também por técnica de PCR. Este laboratório é
coordenado por 2 médicos com formação nos EUA e 5 técnicos
que realizam todas as tipagens HLA. E, finalmente o setor conta
com um laboratório de criopreservação de células para
transplante de medula óssea. O Laboratório utiliza a mesma
metodologia empregada em centro de referência internacional
(Fred Flutchunson Câncer Research Center). O programa de
congelamento utiliza um comgelador programável acoplado a tanque
de nitrogênio que permite uma criopreservação padronizada
evitando-se riscos do congelamento brusco. Encontram-se em fila
de espera aproximadamente 100 pacientes provenientes de todos os
estados brasileiros para transplante de medula óssea.
Probabilidade de se encontrar um doador nos
Registros Internacionais de Medula Óssea: No momento atual a
probabilidade de se encontrar um doador totalmente compatível em
um Banco Internacional é de 1:10.000 doadores. Em relação as
CCU os dados provêm do Registro de Sangue de Placenta do Banco
de Sangue de Nova Iorque. Eles relatam a probabilidade de se
identificar um doador completo menos um antígeno HLA diferente
feito por sorologia. Nesta situação a instituição identificou
em 43% dos pedidos um doador de CCU para o paciente. Deve-se
ressaltar que a maioria destes pacientes não poderiam esperar
mais que 4 meses por uma procura devido a problemas clínicos. Se
os pacientes puderam ser transplantados logo após o diagnóstico
com certeza os resultados utilizando as CCU serão melhores.
A. Estabelecer o programa de coleta e
congelamento das CCU;
B. Realizar o transplante de medula
utilizando-se das CCU;
C. Determinar a taxa de recuperação
hematopoética utilizando as CCU nos transplantes alogênicos
não-aparentados;
D. Avaliar a incidência e severidade da DECH
utilizando as CCU nos transplantes alogênicos de medula óssea
não-aparentados.
A. Inclusão:
Qualquer doença hematológica que necessite um
transplante alogênico de medula de acordo com o protocolo com o
protocolo para tal doença.
B. Exclusão:
1. Idade superior a 55 anos;
2. Disponibilidade de um doador HLA-compatível;
3. Disponibilidade de um doador não-aparentado do Banco de Medula Óssea da FPS/HSP ou outro Registro de Medula Óssea;
4. Expectativa de vida rebaixada pela progressão da doença;
5. Doença hepática severa (insuficiência hepática severa);
6. Pacientes com insuficiência renal;
7. Pacientes com leucoencefalopatia ou que receberam mais de 3.000 cGy no cérebro;
8. Pacientes HIV positivos.
As CCU são obtidas do cordão umbilical da
placenta. A mãe deverá autorizar. por consentimento informado,
a utilização das CCU no banco de cordão umbilical. O doador
pode ser tanto um HLA-idêntico como um antígeno diferente com o
paciente (classe I) determinado por sorologia ou classe II
determinado por DNA de baixa resolução.
As CCU devem conter pelo menos 0,5 x 107
células nucleadas/kg de peso do receptor. Contudo deve ser
salientado que não houve correlação entre o número de
células nucleadas ou quantidade de progenitores hematopoéticos
na determinação da recuperação hematopoética. Não houve
também tentativa de se identificar a quantidade de células
CD34+ e a recuperação hemotopoética até o momento.
O servo de coleta e armazenamento das CCU, no
caso presente, o Servo de Criobiologia da FPS/HSP será o
responsável pela obtenção das informações junto com as mães
. Qualquer história médica pregressa da mãe deverá ser
investigada por um médico da equipe. Os seguintes testes
sorológicos são importantes: testes para sífilis, Chagas,
IIbsAg, Anti-Hbc, anticorpos anti-HIV e anti-HIV2, anticorpos
anti-CNV, HSV 1 e 2, anti-HTLVI e anti-HCV. Estes testes na sua
maioria são regularmente realizados, na FPS/HSP e deverão estar
disponíveis no momento que for solicitado pelo médico do
paciente.
O processo da coleta das CCU já se encontra
bem definido e segue protocolo padrão (ver anexo1). A coleta
visa obter o máximo de quantidade possível de célula do
cordão para que possam ser realizadas posteriormente. A contagem
das CCU é realizada antes do congelamento, bem como testes de
viabilidade celular serão realizados neste momento
(determinação de células CD34+ e cultura de curto prazo).
Processo de criopreservação das células do
cordão umbilical
A técnica a ser utilizada neste projeto será o do congelamento com taxa controlada em aparelho programável por computador, onde o declínio da temperatura e registro em gráfico e ocorre a razão de -1ºC/minuto até -40ºC, após o qual a taxa de queda da temperatura acelera para -10ºC/minuto, atingindo a temperatura de -80ºC. As bolsas contendo o produto das CCU são transferidas para um freezer mecânico a -120ºC ou -145ºC. Nessas condições as células criopreservadas podem ser mantidas por até 15 anos sem perda significativa da viabilidade celular.
A solução de criopreservação empregada no
laboratório de Criobiologia da FPS/ é composta de 20% de
DMSO(Cryoser( , Research Industries Co. Utah), 40% de plasma
autólogo e 40% de meio de cultura (TC 199, Instituto Adolfo Lutz
SP). Esta solução é resfriada à temperatura de 4ºC antes do
uso e adicionada na proporção de 1:I ao produto da CCU. O
produto final apresenta uma concentração de 10% de DMSO, 20% de
plasma autólogo e 20% de meio TC199.
O grande problema desta técnica é a
necessidade de grandes espaços para adequar os freezeres
necessários à contagem. Recentemente, uma nova metodologia
está sendo adotada por especialidades em outros países. É o
emprego de máquinas automatizadas para o congelamento em larga
escala de células. Deve-se lembrar que é necessário ter um
estoque de CCU para se aumentar as possibilidades de se achar um
doador compatível. Este equipamento faz automaticamente a
separação das células por meio de gradiente de separação com
Ficoll e posteriormente congela as células em temperaturas de
-196ºC. Outra vantagem é o pequeno espaço que o mesmo ocupa
além de manter as células em nitrogênio líquido.
Para se avaliar o potencial hematopoético das
células e após o congelamento dispõe-se de alguns métodos.
Dentre os disponíveis existe o da cultura celular. Neste
técnica avalia-se a capacidade proliferativa das células-tronco
hematopoéticas. Amostras de CCU são centrifugadas em um
gradiente de densidade utilizando-se o Ficoll-Hypaque (densidade
1,077) a 1.6600 rpm à temperatura ambiente por 30 minutos. As
células mononucleares do produto na concentração de 5 x 104
são cultivadas em meio contendo soro fetal bovino,
mentilcelulose e fatores de crescimento (Interleucina-3
eritropoetina e GM-CSF). A determinação das unidades formadoras
de colônias permite avaliar a atividade clonogênica das
células coletadas. Neste trabalho será feita a correlação
entre as unidades formadoras de colônias infundidas e a
recuperação hematopoética.
Todos os pacientes participantes do Programa
deverão receber um consentimento informado que será assinado no
momento em que se achar um cordão umbilical adequado
esclarecendo que este procedimento está em investigação.
Testes rotineiros de histocompartibilidade
Os testes rotineiros de tipagem serão realizados pelo laboratório de histocompatibilidade da FPS/HSP, o que os realiza também para o banco de medula óssea :
A. Antígenos classe I A, B, C, serão utilizados testes sorológicos padrões para identificar os 87 antígenos HLA A, B e C definidos pela Organização Mundial da Saúde.
B. Antígenos HLA DR, DQ, DP. A tipagem será
realizada por testes sorológicos padrões. A tipagem por DNA
será feita quando se identificar um paciente que possa se
beneficiar do transplante.
O regime de condicionamento a ser utilizado
será aquele aprovado pelo Servo de Transplante de Medula Óssea
da FPS/HSP para cada doença. Já existem protocolos com os
regimes de condicionamento para série de patologias estando
disponíveis para consulta.
Medula óssea ou células-tronco guardadas como
proteção
Naqueles pacientes onde é possível se guardar
medula óssea ou células-tronco periféricas do próprio
paciente (autoplástico) antes do transplante, isto será
realizado. Trata-se na maioria dos casos de pacientes portadores
de doença crônica ou leucemias agudas em remissão (doenças
onco-hematológicas). O Intuito é de se ter uma fonte de
células reserva em caso quando as CCU não forem suficientes
para a recuperação hematopoética após altas doses de
quimioterapia. Um mínimo de 2,5 x 106 cels CD 34+kg serão
coletadas após estimulo com G-CSF. Estas células serão
infundidas caso até o dia -40 pós TMO não houver evidências
de recuperação hematopoética verificada através da contagem
de granulócitos superiores a 500/mm3 no sangue periférico ou
aspirado de medula óssea que sugira hipoplasia ou aplasia de
medula óssea.
Equipamento e materiais necessários ao projeto (vide
item orçamentos)
01. Broxmever HE, Douglas GW, Hangoc G. Cooper
S. Bard J. English D, A my M. Thomas L, Boyse EA, Human umbilical
cord blood as a potencial source of transplantable hematopoicric
stem/progenitor cells, Proc. of Natl. Acad. Sei of United States
of America. 1989:86(10):3828-3832.
02. Gluckman E. Broxmeyer HA, Auerbach AD,
Friedman HS, Douglas GW, Devergie A, Esperou H, Therry D, Socie
G, Lehn P. Hematopoietic reconstítution in a patient with
Fanconi's Anemia by means of umbilical-cord blood an
HLA-identical sibling NEJM. 1989:321(17):1174-1178.
03. Vilmer E, Steckers G, Rahimy C, Denamur E,
Elion J, Lescouer B, Tiercy JM, Gerta J, Blot P. HLA-mismatched
cord-blood transplantation in a patient with advanced leukemia,
Transplantation 1992:53(5):11551157.
04. Wagner JE, Broxmeyer HE,Byrd RL, Zehnbauer
B, Schmeckpeper B, Shah N, Grifin C, Emmanuel PD, Zuckerman KS,
Cooper S. Transplantation of umbilical cord blood after
myeloablative therapy analysis of engraftment. Blood
1992:79(7):1874-1881.
05. Vowels MR, Tang RL, Berdoukas V, Ford Dm
Thirry D, Purtilo, Glouckman E, Brief report: correction of
X-linked lymphoproliferative disease by transplanation of
cord-blood stem cells. NEIM 1993:339(22):1623-1625.
06. Bogdanic V. Nemet D, kASTELAN a, Latin V,
Pertrivecki M,Mrsic M, Umbilical cord-blood transplantation in a
patient with Philadelphia chromosome-positive chronic myeloid
leukemia. Transplantation 1993:56(2):477-479.
07. Harris DT, Schumacher MJ, Rychlik S,
Acevedo A, Rubinstein p, Bard J & Boyse EA. Collection,
separation and cryopreservation of umbilical cord blood for use
in transplantation. Bone Marrow Trnspl. 1994:13:135-143.
08. Harris DT, LoCascio J& Besençon FJ.
Analysis od the alloreactive capacity of human cord blood:
implications for graft-versus host disease. Bone Marrow Transpl.
1994:14:545-53.
09. Gluckman E, Wagner L, Hows J, Kernan N,
Bradley B & Broxmever HE. Cord blood banking for
hematopoietic stem cell transplantation: an international cord
blood transplant registry. Bone Marrow Transpl. 1993:11:199-200.
10. Risdon G, Gaddy J, Stehman FB &
Broxmeyer HE. Proliferative and cytotoxic responses of human cord
blood T lymphocytes following allgeneic stimulation. Cell.
Immunol 1994:154:14-24.
PROJETO CORDÃO UMBILICAL
MATERIAL
NECESSÁRIO E ORÇAMENTO
01. Cryocell Computer controlled celular
storage unit: com sistema de "back-up" alimentado por
nitrogênio líquido e capacidade de estocagem de 35.000 unidades
de células, Cryocell International Inc.( - Preço: US$
1,750,000.00.
02. Freezer de ultra-baixa temperatura
(-150ºC), marca REVCO, solicitação: 1 unidade. Preço
unitário: US$ 15,000.00.
03. Microscópio invertido com objetiva e
contraste de fase, marca Leica, modelo Leitz DN-II, 1 unidade .
Preço: US$ 21,975,00.
04. Banho Maria (37ºC), marca PRECISION
SCINTIFIC, 1 unidade. Preço: US$ 609.00.
05. Micropipeta 100-1000ul, marca Gilson, 1
unidade. Preço: R$ 650,00.
6. Micropipeta 1-100ul, Gilson, 1 unidade.
Preço: R$ 650,00.
07. Balança digital: marca DENVER, modelo
XL-6100, 1 unidade. Preço: US$ 694.00.
Orçamento
para cultura de células:
1) 480 Placas para cultura de tecidos 35mm x
10mm - Marca NUNC - Cód. 174926 - Total: US$ 433,80
2)1000 Placas para cultura de tecido 15mm x 10mm - Marca NUNC - Cód. 172958 - US$ 1,20 - Total US$ 1,200.00
3) 500 para centrífuga de 50ml - estéreis -
descartáveis - Marca FALCON - Cód. 8350-20 pc.c/25 unid -
Total: US$ 242,00
4) Pipetas sorológicas estéreis descartáveis:
10 pacotes - 1ml - Marca COSTAR -c/100 - R$ 65,00 - Total: R$ 650,00
20 pacotes - 2ml - ¨ ¨ -c/100 - R$ 65,00 - Total: R$ 650,00
20 pacotes - 5ml - ¨ ¨ -c/50 - R$ 38,00 - Total: R$ 760,00
20 pacotes -10ml - ¨ ¨ -c/50 - R$ 43,00 -
Total: R$ 860,00
5) 500g Metilcelulose (MC), marca FISHER - 4000
centipoises - R$ 286,00
6) Soro Fetal Bovino (FBS) - Marca Gibco -
Cód. 2406000 - 100ml - US$ 70,20 6 unidades - Total: 421.20
7) 100g Albumina Sérica Bovina (BSA) - Marca
Gibco - Cód 11018-041 - US$ 42.00/10g - Total: US$ 420.00
8) 100ML DE 2-Mercaptoetano (BME)-Marca Sigma -
Cód. M 7522 - US$ 45,00
9) Metilprednisolona (MP) - US$ 300,00
10) cx - MEM (meio de cultura ) - Marca Gibco -
Cód. 11900-024 - 1 caixa de 10 x 1000ml - 2 pacotes, R$ 84,00/cx
- Total: US$ 168,00
11) Eritropoietina (EPO) - 4,000 units - US$
47,00
12) IL-3 interleucemia (IL-3) - US$ 495,00/50ug
13) Fator de crescimento para macrófagos
(GM-CSF) - US$ 106.25
14) 500 tubos de centrifuga de 15ml - Marca
Corming - Cód. 8046 - US$ 201.60
15 Meio de cultura Iscove's - Marca Gibco -
Cód 1200-036 - 1 caixa de x 1000ml - R$ 110,88/caixa
Orçamento para congelamento de células:
16) DMSO (dimethylsulfoxide), marca Cryoserv da
Research Industries, 10 ampolas/case. Quantidade necessária:40
cases. US$72.00/case - Total: US$2,880.00
17) Bolsas especiais para congelamento marca
Cryocyte da Baxter, 24/case. Quantidade necessária: 200 bolsas.
US$5.86/bolsa - Total: US$1,172.00
18)Anticorpos monoclonais:
CD 14 (Leu M3) FITC, marca Becton & Dickison. Quantidade necessária: 3 vials. US$ 380.00/vial. Total US$ 1,140.00
CD 34 (HCPA - 2) PE, marca Becton & Dickison. Quantidade necessária: 3 vials. US$435,00/vial. Total US$1.305.00
CD 45 FITC , marca Becton & Dickison. Quantidade necessária: 3 vials. US$ 380,00/vial. Total US$ 1.140,00
Mouse IgGI PE, marca Becton & Dickison.
Quantidade necessária: 3 vials. US$145,00/vial. Total US$ 435.00
19) Meio de cultura 199, marca GIBCO, 1000ml.
Quantidade necessária: 20 litros, R$ 47,00/litro - Total:
R$940,00
20) DNAse I, Tipo II s, 1 vial, US$ 56,15/vial
Total aproximado: US$ 1,800.514.00 R$ 5.798,8