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INTRODUÇÃOA Histologia é a parte da Anatomia que estuda a estrutura, a função e a composição dos tecidos e órgãos. O progresso da Histologia está diretamente relacionado ao desenvolvimento de instrumentos como o microscópio e de técnicas de estudo como a cultura de células, as técnicas de radioautografia e de imuno-histoquímica, que possibilitaram a localização precisa nos tecidos de macromoléculas específicas de proteínas e ácidos nucléicos, por exemplo.
Além disso, os melhoramentos obtidos pela Bioquímica, Fisiologia, Imunologia e Patologia possibilitaram o entrelaçamento desses ramos da ciência com a Histologia, que é atualmente estudada no contexto da Histofisiologia, Histoquímica, Imunohistoquímica e Histopatologia.
Embora as células do corpo possam ser isoladas por métodos especiais e examinadas de várias maneiras, o meio mais simples e comum de estudá-las é examinando-as em sua localização normal no corpo, onde se encontram associadas umas às outras. Esse método apresenta a vantagem de mostrar como os diferentes tipos de células se agrupam em diversas regiões do corpo; porém, a sua execução depende da preparação e do estudo do que chamamos cortes de várias regiões do corpo.
Na presente pesquisa, apresentamos, de maneira sucinta, os métodos utilizados na Histologia para a preparação de lâminas com vista à observação microscópica de tais cortes. Além disso, falamos sobre as principais formas de microscopia existentes na atualidade.
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TÉCNICAS HISTOLÓGICASA preparação de lâminas para a observação ao microscópio segue a seguinte seqüência de passos:
Antes da coleta, deve-se verificar a origem e o tipo de material selecionado, sendo ideal que o mesmo seja normal (não-patológico) e bem conservado.
Retira-se, então, um fragmento do material utilizando-se uma pinça ou navalha afiada. Para que não haja danificação do tecido, é importante evitarem-se procedimentos que provoquem choques osmóticos, congelamentos, compressões, trações, dessecamentos etc.
A
Apesar de ser possível a fixação a partir de agentes físicos – como o calor, usado em bacteriologia –, em Histologia utiliza-se quase que exclusivamente a fixação química. As substâncias que executam o processo de fixação são denominadas fixadores, e têm como principal função desnaturar as proteínas e insolubilizá-las, de modo a tornarem o tecido a ser estudado mais rígido e com as suas características estruturais preservadas.
O mecanismo de ação dos fixadores é pouco conhecido, mas sabe-se que todos possuem vantagens e desvantagens. Os cientistas desenvolveram misturas empíricas de fixadores para compensar suas principais desvantagens. O volume ideal de fixador é de 40 vezes o volume da peça, e nunca devendo ser inferior a 20 vezes.
Os principais fixadores químicos são: formol, líquido de Boin, líquido de Helly, aldeído glutárico, tetróxido de ósmio, cloreto mercúrico, ácido pícrico etc. Um dos melhores fixadores para trabalhos de rotina com o microscópio óptico é o formaldeído – também conhecido como formol – a 4%, e, para o Microscópio Eletrônico, é a fixação dupla, primeiro em solução tamponada de aldeído glutárico, e, depois, em solução também tamponada de tetróxido de ósmio.
O frasco que conterá a peça deve ter boca suficientemente ampla para que a mesma entre sem compressão. O processo de fixação dura cerca de 12 horas, dependendo do fixador e do tamanho da peça.
A
desidratação visa à substituição da água ou do solvente aquoso do fixador por um solvente não polar. Esse processo atua como primeira etapa para a inclusão em parafina ou resina, de que trataremos adiante.
A água presente nos tecidos é extraída pela passagem do material em concentrações crescentes de etanol, geralmente de 70% até etanol puro (100%).
Para a realização da
desidratação, utilizam-se outras substâncias, além do álcool etílico. Observe a tabela abaixo, com os principais agentes desidratantes:PRINCIPAIS AGENTES DESIDRATANTES |
Álcool Etílico (mais usado) |
Acetona |
Álcool Butílico Normal |
Álcool Isopropílico |
Álcool Metílico |
A
clarificação tem como objetivo remover o álcool, que substituíra a água no interior dos tecidos, por um solvente que seja, ao mesmo tempo miscível com álcool e com a parafina. (A parafina é muito usada no processo de inclusão, explicado adiante.)Os agentes clarificadores, além de tornarem o tecido transparente, removem a gordura dos mesmos, e trazem o inconveniente de causarem o risco de o material em estudo se tornar duro e friável.
PRINCIPAIS AGENTES CLARIFICADORES |
| Xilol |
| Benzol |
| Toluol |
| Ciclohexanona |
Usando o xilol como agente clarificador padrão, podemos seguir a seguinte seqüência de passos para obtermos o resultado desejado:
Agente Clarificador |
Tempo de Uso |
Álcool - Xilol |
2 h |
Xilol |
1 h |
Xilol |
½ h |
OBSERVAÇÃO:
Antes de transferir o material para o xilol, deve-se verificar se houve desidratação perfeita. Coloca-se em um frasco transparente, com xilol, algumas gotas do álcool que continha a peça. A ausência de turvação indica a desidratação perfeita. Caso haja turvação, será preciso um novo banho de álcool absoluto no material.O processo de inclusão visa a permitir que se façam cortes do tecido, para que haja uma melhor visualização do seu conteúdo a nível microscópico. Constitui-se na continuação do processo de diafanização, no qual o tecido é embebido com um agente clarificador – que, nosso caso pode ser o xilol.
A fim de que se possam obter cortes suficientemente finos para serem observados ao microscópio, os tecidos devem ser embebidos e envolvidos por uma substância de consistência firme. As substâncias mais usadas para essa finalidade são: gelatina, celoidina, parafina e resinas epóxi. A parafina é de uso rotineiro para a microscopia óptica, enquanto que, para a microscopia eletrônica, utilizam-se resinas do tipo epóxi (Efon ou Araldite).
Como a microscopia óptica é mais comum e está no nosso contexto, deter-nos-emos no processo de inclusão em parafina:
Mergulham-se as peças em parafina fundida, geralmente a 60 0C, no interior de uma estufa. A essa parafina podem ser acrescentadas ceras, com o intuito de melhorar a fase seguinte, que é a do corte. Devido à temperatura da estufa, o xilol começa a se evaporar e vai sendo gradativamente substituído pela parafina.
A inclusão é uma fase crítica pelo fato de, se muito rápida, haver o risco de não retirar totalmente o xilol. Além disso, o calor em demasia pode torrar os tecidos, introduzindo artefatos - alterações no material produzidas pelas técnicas utilizadas – na peça a ser estudada.
Para que os tecidos possam ser examinados ao microscópio, precisam ser cortados em fatias finas. Esses cortes são feitos num aparelho denominado micrótomo.
Os tecidos destinados ao estudo o microscópio óptico são cortados geralmente com 1 a 6 µm de espessura, enquanto que os destinados ao estudo no microscópio eletrônico medem de 0,01 a 0,2 µm.
Os micrótomos que cortam tecidos incluídos em parafina utilizam navalha de aço, e os que cortam tecidos incluídos em resinas usam navalhas de vidro ou diamante.
No caso da microtomia para o estudo ao microscópio óptico, o bloco de parafina contendo o tecido incluído é colocado no micrótomo, que, quando acionado, faz com que o bloco entre num movimento de sobe e desce. Após cada subida, o bloco sofre um avanço de alguns micrômetros, e, ao descer, é seccionado pela navalha do aparelho, deixando uma fatia de tecido incluído em parafina.
Cada fatia adere à seguinte, formando uma fita, que se põe a distender flutuando em água quente e da qual os cortes são individualizados por meio de pinça e recolhidos sobre as lâminas de vidro.
Examinemos a seqüência de processos na
coloração pela hematoxilina e eosina:*
O Bálsamo do Canadá tem índice de refração igual ao do sistema óptico do microscópio, o que evita artefatos de refração.
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MICROSCÓPIOSMicroscópios são instrumentos ópticos destinados à ampliação e observação de pequenos objetos. Há dois tipos básicos de microscópios: simples, as lupas e os compostos, sistema óptico formado por dois conjuntos de lentes, objetiva e ocular. Abaixo estão detalhados alguns tipos de microscópios compostos, de grande importância para a Histologia.
O microscópio óptico é constituído de duas partes: uma mecânica (parte física propriamente dita: platina, braço, canhão e demais estruturas) e uma óptica (que engloba a parte das lentes: o condensador, que projeta um feixe luminoso concentrado sobre o objeto em estudo; a objetiva, que projeta a imagem ampliada do objeto para a ocular e a ocular, que novamente aumenta a imagem, e projeta sobre a retina, sobre uma tela ou sobre uma chapa fotográfica). A ampliação total do microscópio é dada pelo aumento da objetiva multiplicado pelo aumento da ocular. A resolução é o que determina o poder de nitidez do microscópio, e esta é definida como sendo a menor distância para que duas partículas apareçam como objetos separados. O limite resolutivo depende essencialmente da objetiva.
O microscópio de contraste de fase representa um grande passo no desenvolvimento da técnica histológica, pois permite o estudo de muitos detalhes celulares in vivo . Ele foi construído levando-se em consideração os diferentes índices de refração de um corpo, o que faz com que a luz o atravesse com variações de velocidade. Como as diversas estruturas celulares possuem diferentes índices de refração , causam atrasos diferentes nas ondas luminosas que as atravessam, dando origem a diferenças de fase entre as ondas luminosas emergentes, mas essas diferenças não são visíveis. Neste microscópio existem dispositivos especiais que transformam essas diferenças de fase em diferenças de amplitude, dando, em conseqüência diferenças de intensidade luminosa, para as quais a retina é sensível.
O microscópio confocal utiliza raios laser e gera imagens de planos ópticos do tecido em exame. Isto torna possível imagens muito nítidas.
O microscópio de polarização revela a presença de moléculas alongadas e orientadas através de filtros polaróides. O primeiro é colocado no condensador e recebe o nome de polarizador. O segundo ou analisador é colocado entre a objetiva e a ocular. Se entre os dois filtros existirem estruturas contendo moléculas orientadas, estas aparecerão brilhantes contra um fundo escuro. Isto acontece porque as moléculas orientadas são anisotrópicas ou birrefrigentes e modificam o eixo da luz recebida do polarizador.
Na técnica da microscopia de fluorescência, nesta técnica utiliza-se um microscópio com uma fonte de luz ultravioleta. Depois da objetiva do microscópio são colocados filtros que deixam passar a luz mas eliminam a radiação ultravioleta para proteger os olhos do observador. As substâncias fluorescentes aparecem como estruturas brilhantes contra um fundo escuro. Alguns compostos fluorescentes são constituintes normais das células, como a vitamina A. Vários corantes são fluorescentes, e , tendo afinidade por certos componentes celulares, são utilizados para a sua identificação.
A microscopia eletrônica de transmissão tem alto poder resolutivo. O movimento do elétron, devido à sua emissão pelo catódio, é que permite formação da imagem do objeto na objetiva, quando defletido por lentes eletromagnéticas, e, de maneira semelhante, ao que ocorre no microscópio óptico, o condensador focaliza o feixe no plano do objeto. Devido ao fato de serem os elétrons facilmente desviados pelo objeto, torna-se necessário utilizar cortes muito finos de tecidos (20 a 100 nanômetros). Os cortes são feitos em ultramicrótomos. Enquanto no microscópio óptico a luz é absorvida pelas estruturas coradas, no eletrônico os elétrons são desviados por porções do objeto que contenham átomos de elevado peso atômico. O resultado é que as estruturas que desviam os elétrons aparecem escuras na tela fluorescente e são chamadas de elétron-densas. A capacidade de desviar os elétrons depende do número atômico, por isso se costuma impregnar os cortes de tecidos com metais pesados a fim de aumentar o contraste, resultando assim uma imagem nítida e bem visível. Os metais mais usados para essa "coloração eletrônica" são o ósmio, o chumbo e o urânio.
Na microscopia eletrônica de varredura, é interporsta uma bobina de varredura entre a lente eletromagnética e o objeto, a qual provoca um desvio do feixe dos elétrons, de tal modo que o mesmo incide sobre o objeto ponto por ponto, numa seqüência determinada. O objeto, por sua vez, não se deixa atravessar pelo feixe eletrônico, devido à sua espessura e a uma cobertura feita por evaporação de metal pesado sobre a superfície. Desse modo, o feixe que incide sobre o objeto sofre reflexões, originando elétrons secundários, os quais são captados por detetores especiais que geram um sinal elétrico, transferido para um tubo de vídeo.
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CONCLUSÃOObservamos que o progresso das técnicas histológicas e da microscopia tem contribuído para uma melhoria o estudo dos organismos a níveis celular e histológico. Esperamos que a continuidade desse avanço os mostre um caminho que nos leve à solução de problemas ainda não resolvidos na área da saúde.
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REFERÊNCIAS
